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硅胶柱层你了解多少

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一.硅胶柱层析原理

  硅胶层析法分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离, 极性较大的物质与硅胶作用强,保留时间长,极性弱的物质与硅胶作用弱,保留时间短,物质在固定相与流动相间通过反复的吸附、解吸过程,得以分离。

流动相选择,极性小的用乙酸乙酯/石油醚系统;极性较大的用甲醇/氯仿系统;极性大的用甲醇/水/正丁醇/醋酸系统;如有拖尾,可根据具体情况,加入少量氨水或冰醋酸

 

二.硅胶层析操作方法

  1.硅胶量确定。称取一定量的硅胶,根据所要装填的柱子体积及上样量来确定(上样量5%以内),极难分的物质,可适当增加硅胶量。硅胶的密度在0.5-0.6左右,由此可计算出装填一定体积的柱子需要称取的硅胶质量。。

 

2.制备匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂,玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系,就用石油醚制备匀浆;如果洗脱剂是氯仿/醇体系,就用氯仿制备匀浆。

 

3.装柱。柱底出口关闭,无筛板的可用棉花替代,加入约1/5体积石油醚(氯仿),将匀浆一次性倾入柱子中。然后打开柱子底部出口,待硅胶床沉降稳定后,关闭出口(注意不要使液面低于硅胶床)。

 

4.压实。沉降完成后,用双联球或气泵加压,泵入洗脱液,直至床面稳定。

 

5.上样。上样后,加入洗脱剂洗脱,可将脱脂棉置于硅胶床表面。避免添加流动相时冲坏硅胶表面。

 

6.过柱和收集。采用合适的洗脱液洗脱,根据样品情况可采用梯度洗脱。分离出的样品采用分部收集,具体每个馏分的体积可根据实际的分离效果来确定,一般情况下以柱体积的10%为一个馏分来收集。  

 

7.检测。使用专用喷显剂,只使用用紫外检测,可能会损失一些样品,紫外的灵敏度一般比喷显剂低1-2个数量级。

三.柱层析经验

 

硅胶层析原理及操作

 

1.柱子填装

 

硅胶柱子装填,有两种方法:即湿法装柱和干法装柱。不论干法还是湿法,硅胶(固定相)床的表面要平整,柱床径高比1:10以上,太短塔板数不够,太长会产生轴向扩散。

 

湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后,再填入柱子中,然后再加压用洗脱剂剂“走柱子”,此法的优点是柱子装的比较结实,没有气泡。

 

干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶,然后再轻轻敲打柱子两侧,至硅胶界面不再下降为止。干法装柱较方便,缺陷在于洗脱时时,由于溶剂和硅胶之间的吸附放热,容易产生气泡,在使用低沸点的洗脱剂更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉,但是一旦撤去压力,气泡就会释放出来。

 

解决的办法是:1)硅胶一定要装实;2)用较多的溶剂平衡柱子

 

 

 

2.上样:

 

上样也有干法和湿法之分;

 

干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后,加入少量硅胶,拌匀后再旋去溶剂,然后小心加到柱子的顶层。

 

湿法上样就是用尽量少溶剂(最好就是洗脱剂,如果洗脱剂的溶解度不好,则可以用极性较大的溶剂,但必须少量)将样品溶解后,用滴管转移得到的溶液,沿着层析柱内壁均匀加到柱床顶端。打开柱子底部出口,使用样品溶液完全进入柱床,关闭出口。然后用少量溶剂洗下管壁上残留的样品,与前面相同的操作,加样完毕,开始洗脱。

 

3.洗脱:

 

洗脱剂可采用TLC分析得到的展开剂比例稀释一倍后的溶剂。通常用正压,也可以用负压,加快洗脱速度。