硅胶柱层你了解多少

一．硅胶柱层析原理

　　硅胶层析法分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离， 极性较大的物质与硅胶作用强，保留时间长，极性弱的物质与硅胶作用弱，保留时间短，物质在固定相与流动相间通过反复的吸附、解吸过程，得以分离。

流动相选择，极性小的用乙酸乙酯/石油醚系统；极性较大的用甲醇/氯仿系统；极性大的用甲醇/水/正丁醇/醋酸系统；如有拖尾，可根据具体情况，加入少量氨水或冰醋酸

二．硅胶层析操作方法

　　1.硅胶量确定。称取一定量的硅胶，根据所要装填的柱子体积及上样量来确定（上样量5%以内），极难分的物质，可适当增加硅胶量。硅胶的密度在0.5-0.6左右，由此可计算出装填一定体积的柱子需要称取的硅胶质量。。

2.制备匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂，玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚制备匀浆；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿制备匀浆。

3.装柱。柱底出口关闭，无筛板的可用棉花替代，加入约1/5体积石油醚（氯仿），将匀浆一次性倾入柱子中。然后打开柱子底部出口，待硅胶床沉降稳定后，关闭出口（注意不要使液面低于硅胶床）。

4.压实。沉降完成后，用双联球或气泵加压，泵入洗脱液，直至床面稳定。

5.上样。上样后，加入洗脱剂洗脱，可将脱脂棉置于硅胶床表面。避免添加流动相时冲坏硅胶表面。

6.过柱和收集。采用合适的洗脱液洗脱，根据样品情况可采用梯度洗脱。分离出的样品采用分部收集，具体每个馏分的体积可根据实际的分离效果来确定，一般情况下以柱体积的10%为一个馏分来收集。　　

7.检测。使用专用喷显剂，只使用用紫外检测，可能会损失一些样品，紫外的灵敏度一般比喷显剂低1-2个数量级。

三．柱层析经验

硅胶层析原理及操作

1．柱子填装

硅胶柱子装填，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱。不论干法还是湿法，硅胶（固定相）床的表面要平整，柱床径高比1:10以上，太短塔板数不够，太长会产生轴向扩散。

湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用洗脱剂剂“走柱子”，此法的优点是柱子装的比较结实，没有气泡。

干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止。干法装柱较方便，缺陷在于洗脱时时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热，容易产生气泡，在使用低沸点的洗脱剂更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是一旦撤去压力，气泡就会释放出来。

解决的办法是：1）硅胶一定要装实；2）用较多的溶剂平衡柱子

2．上样：

上样也有干法和湿法之分；

干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂，然后小心加到柱子的顶层。

湿法上样就是用尽量少溶剂（**就是洗脱剂，如果洗脱剂的溶解度不好，则可以用极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，用滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加到柱床顶端。打开柱子底部出口，使用样品溶液完全进入柱床，关闭出口。然后用少量溶剂洗下管壁上残留的样品，与前面相同的操作，加样完毕，开始洗脱。

3．洗脱：

洗脱剂可采用TLC分析得到的展开剂比例稀释一倍后的溶剂。通常用正压，也可以用负压，加快洗脱速度。